叶绿素的测定步骤:
1.采集处理的新鲜叶片,擦净组织表面的污物,剪碎(去掉中脉),混匀。
2.准确称取剪碎的新鲜样品.2g,共3份。分别置于25ml的容量瓶中,用乙醇浸泡24小时。注意要避光保存。,95%:=XXX=
2.743A
6.486=
5.24H2=XXX一
3.摇匀,取提取液倒入比色杯中,在665,649,470nm波长下测定其消光度(OD值,以95叱醇为空白对照,按公式计算色素浓度(m)j5J9A
8.6一8J24
6.642
2.2244
6.4862A3Cg-
9.764Q20a是叶绿素a的浓度,Cb是叶绿素b的浓度,Ca Cb是叶绿素总浓度,C_.c为类胡萝卜素的浓度。
A665A649A470分别为叶绿体色素提取液在波长665,649,470nm下的消光度。叶绿素含量(m)=(色素的浓度_提取液的体积_稀释倍数品鲜重叶绿素含量:采用分光光度计法测定,所得值为单位质量叶片的含量。
叶绿素总量:为单位质量叶片叶绿素含量乘以叶片鲜重叶片含水率=(鲜重-干重重_100%GS酶活性及可溶性蛋白的测定
一、步骤:GS酶活性:
1.取冷冻小麦样品.5g样品置于预冷的研钵中。
2.加入少许石英砂研磨,加入
1.5ml的Trs-Hcl缓冲液(分两次加入)继续研磨匀浆后倒入2ml离心管中。
3.于4C,13,000n离心20,上清液即为粗酶液。
4.按照以下顺序向5ml离心管中分别加入:.6ml咪唑-盐酸缓冲液 .4ml谷氨酸钠 .4mlATP-Na .2mlMgSO4 .3ml粗酶液 .3mlTrs-HCL缓冲液。
5.于25水浴5分钟,加入.2ml羟胺反应15分钟后,加入.8mlFeCl3终止反应。
6.混合液于8000n离心8mn后取上清液于540nm比色测定吸光值(对照用Trs-HCL代替酶液)。可溶性蛋白:
1.向2ml离心管中加入95uLTrs-HCL缓冲液,再加入5uL测酶活时的上清液(即粗酶提取液),混匀,加入1mLBradford试剂,颠倒混匀反应3-5mn。
2.测定反应液在595nm下的吸光值。(对照100uLTrs-HCL 1mLBradford试剂)。
二、试剂配制1100mmo、PH
7.6的Trs-HCL缓冲溶液把
6.057gTrs、.1016gMgcl
2、.1461gEDTA、.3520?-巯基已醇溶解后在500ml容量瓶中混合,加入去离子水450ml,用1MHCL调PH=
7.6,最后用去离子水定溶到500ml。
2025mo、PH
7.0的咪噪一盐酸缓冲液取
4.255g咪噪于容量瓶中,加去离子水20l,用1MHCLPH=
7.0,用去离子水定溶到250ml。
3.3mo、PH
7.0的谷氨酸钠溶液称取
5.6139g谷氨酸钠于100ml容量瓶中,加入去离子水80ml,用1MHCL?PH=
7.0,用去离子水定容到100ml。430mmo、PH
7.0的ATP-Na溶液1gATP-Na于容量瓶,加入去离子水45ml,用NaOHMPH=
7.0,再加入5ml去离子水。5.5mo的MgSOt液称取
3.81gMgSOF250ml容量瓶中,加入20l去离子水使其充分溶解,后定容到250ml。6羟胺试剂
(1)1moNH2OH-HCL
XXX去离子水定溶到50ml
(2)1moNaOH
2.0gNaOH用去离子水定溶到50ml使用前等体积混合即可7FeCl3试剂
(1).2moHCL
4.175mlHCL用去离子水定溶250ml
(2)10?Ck6HO10gFeCl
3.6HO于100ml烧杯中,用.2moHCL溶解并定溶100ml。
(3)24%三氯乙酸60g三氯乙酸,用蒸储水定溶250ml
(4)50%HCL50mlHCl用蒸馏水定溶到100ml等体积混合
(2)、(3)、(4)三种溶液即可81moHCL
20875ml浓HCUt容到250ml。9Broadford试剂:50mg考马斯亮蓝G-250,25mL95%J1,50mL85%磷酸,定容至500mL贮放在棕色瓶中,此溶液在常温下可放置1个月。
三、关于标准曲线制作标准曲线的丫-谷氨酰异羟肪酸用量一般为15区mol之间,按照测定酶活的反应液总体积定容后,加入1mlFeCL3试剂,在540nm处测定光密度,绘制标准曲线。
谷氨酸脱氢酶(GDH活性测定:称取新鲜材料
1.0g于研钵中,加8mL提取液(.2mmolL-1,pH
8.2,Trs-HCl缓冲液)冰浴研磨,转移到10mL离心管中,
4、200n离心20,上清液即为粗酶液。取1mL酶提取液加入2mL反应液B(60即olL-1L-谷氨酸
1.6gmolL-1NAD .36mmol-L-1Trs-HCl缓冲液),以加反应液A(
1.6molL-1NAD .36mmol-L-1TrsHCl缓冲液)为对照,于340nm处比色,每隔1mn记录一次OD值,共记录4次(施氮水平对不同花生品种氮代谢及相关酶活性的影响)。
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